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Gene vectors rau kev kho mob ntawm pulmonary cystic fibrosis yuav tsum tau tsom mus rau cov pa ua pa, txij li kev hloov pauv ntawm lub ntsws peripheral tsis muaj kev kho mob.Kev ua haujlwm ntawm kev kis kab mob kis ncaj qha rau lub sijhawm nyob ntawm tus neeg nqa khoom.Txawm li cas los xij, kev xa cov kua dej xws li cov neeg nqa cov noob diffuse mus rau hauv lub alveoli thaum nqus tau, thiab cov khoom kho mob ntawm txhua tus duab raug tshem tawm sai sai los ntawm kev thauj mucociliary.Kev ncua sij hawm nyob ntawm cov neeg nqa cov noob hauv txoj kev ua pa yog qhov tseem ceeb tab sis nyuaj ua kom tiav.Carrier-conjugated magnetic particles uas tuaj yeem coj mus rau qhov chaw ua pa tuaj yeem txhim kho lub hom phiaj hauv cheeb tsam.Vim muaj teeb meem nrog rau hauv vivo imaging, tus cwj pwm ntawm xws li me me sib nqus hais nyob rau hauv cov pa ntawm lub qhov chaw nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm ib tug thov magnetic teb yog tsis to taub.Lub hom phiaj ntawm txoj kev tshawb no yog siv synchrotron imaging kom pom nyob rau hauv vivo lub zog ntawm ib tug series ntawm magnetic hais nyob rau hauv lub trachea ntawm anesthetized nas nyob rau hauv thiaj li yuav kawm cov dynamics thiab cov qauv ntawm tus cwj pwm ntawm ib leeg thiab tej hais nyob rau hauv vivo.Tom qab ntawd peb kuj tau soj ntsuam seb qhov kev xa khoom ntawm lentiviral magnetic particles nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm magnetic teb yuav ua rau kom cov efficiency ntawm transduction nyob rau hauv cov nas trachea.Synchrotron X-ray duab qhia tau hais tias tus cwj pwm ntawm cov khoom sib nqus nyob ruaj khov thiab txav chaw sib nqus hauv vitro thiab hauv vivo.Cov khoom tsis tuaj yeem rub tau yooj yim hla saum npoo ntawm cov hlab cua uas siv cov hlau nplaum, tab sis thaum lub sij hawm thauj, cov deposits yog concentrated nyob rau hauv qhov kev pom, qhov twg lub magnetic teb muaj zog tshaj.Transduction efficiency kuj tau nce rau 6 npaug thaum cov lentiviral magnetic particles raug xa mus rau hauv lub xub ntiag ntawm magnetic teb.Ua ke, cov txiaj ntsig no qhia tau tias cov khoom sib nqus sib nqus thiab cov hlau nplaum sib nqus yuav yog cov txheej txheem tseem ceeb los txhim kho cov kab mob gene vector targeting thiab transduction theem hauv cov pa conductive hauv vivo.
Cystic fibrosis (CF) yog tshwm sim los ntawm kev hloov pauv hauv ib lub noob hu ua CF transmembrane conductance regulator (CFTR).CFTR protein yog ib qho ion channel uas muaj nyob rau hauv ntau lub hlwb epithelial thoob plaws hauv lub cev, nrog rau cov hlab ntsha, ib qho chaw loj nyob rau hauv lub pathogenesis ntawm cystic fibrosis.Kev tsis xws luag hauv CFTR ua rau kev thauj mus los tsis zoo, lub cev qhuav dej ntawm txoj hlab pa, thiab txo qis ntawm cov dej hauv qhov dej (ASL) qhov tob.Nws kuj tseem cuam tshuam lub peev xwm ntawm mucociliary thauj (MCT) system kom tshem tawm cov pa ntawm nqus pa thiab cov kab mob.Peb lub hom phiaj yog los tsim kho cov noob caj noob ces lentiviral (LV) kom xa cov ntawv luam ntawm CFTR noob thiab txhim kho ASL, MCT, thiab mob ntsws, thiab txuas ntxiv txhim kho cov thev naus laus zis tshiab uas tuaj yeem ntsuas cov ntsuas no hauv vivo1.
LV vectors yog ib qho ntawm cov neeg sib tw rau cystic fibrosis gene therapy, feem ntau vim tias lawv tuaj yeem koom ua ke cov tshuaj kho mob mus tas li rau hauv cov hlab ntsws basal hlwb (airway qia hlwb).Qhov no yog qhov tseem ceeb vim tias lawv tuaj yeem rov ua kom cov dej ib txwm muaj thiab cov kua paug tshem tawm los ntawm kev sib txawv rau hauv kev ua haujlwm ntawm cov noob caj noob ces kho cov kab mob hauv cov hlab ntsws uas cuam tshuam nrog cystic fibrosis, uas ua rau muaj txiaj ntsig rau lub neej.LV vectors yuav tsum raug coj tawm tsam cov pa hluav taws xob, vim qhov no yog qhov kev koom tes hauv ntsws hauv CF pib.Kev xa cov vector ntxaum mus rau hauv lub ntsws yuav ua rau alveolar transduction, tab sis qhov no tsis muaj kev kho mob hauv cystic fibrosis.Txawm li cas los xij, cov kua dej xws li cov neeg nqa cov noob tau tsiv mus rau hauv alveoli thaum nqus tau tom qab yug menyuam 3,4 thiab cov tshuaj kho tau raug tshem tawm sai sai rau hauv qhov ncauj los ntawm MCTs.Qhov ua tau zoo ntawm LV transduction yog ncaj qha ntsig txog lub sijhawm ntev ntawm lub vector tseem nyob ze rau lub hom phiaj ntawm lub hlwb kom tso cai rau cov cellular uptake - "lub sij hawm nyob" 5 uas yog yooj yim shortened los ntawm lub regional airflow raws li zoo raws li kev sib koom tes uptake ntawm mucus thiab MCT hais.Rau cystic fibrosis, muaj peev xwm ua kom ntev LV lub sijhawm nyob hauv cov hlab cua yog qhov tseem ceeb kom ua tiav qib siab ntawm kev hloov pauv hauv cheeb tsam no, tab sis tam sim no tau nyuaj.
Txhawm rau kov yeej qhov teeb meem no, peb xav tias LV sib nqus sib nqus (MPs) tuaj yeem pab tau ob txoj hauv kev ntxiv.Ua ntej, lawv tuaj yeem raug coj los ntawm cov hlau nplaum rau saum npoo ntawm txoj hlab pa los txhim kho lub hom phiaj thiab pab cov gene carrier particles nyob rau hauv txoj cai cheeb tsam ntawm txoj hlab pa;thiab ASL) txav mus rau hauv cov txheej txheem ntawm tes 6. MPs tau dav siv los ua lub hom phiaj kev xa tshuaj tsheb thaum lawv khi rau cov tshuaj tiv thaiv kab mob, tshuaj tua kab mob, lossis lwm cov khoom me me uas txuas rau cell membranes lossis khi rau lawv cov cell nto receptors thiab sib sau ntawm cov qog nqaij hlav hauv muaj hluav taws xob zoo li qub.Sib nqus teb rau kev kho mob qog noj ntshav 7. Lwm txoj hauv kev "hyperthermic" yog tsom tua cov qog hlwb los ntawm cua sov MPs thaum raug oscillating magnetic teb.Lub hauv paus ntsiab lus ntawm magnetic transfection, nyob rau hauv uas ib tug hlau nplaum yog siv los ua ib tug transfection tus neeg sawv cev los txhim khu kev hloov ntawm DNA mus rau hauv lub hlwb, feem ntau yog siv nyob rau hauv vitro siv ib tug ntau yam ntawm non-viral thiab viral gene vectors rau nyuaj-rau-transduce cell kab. ..Kev ua tau zoo ntawm LV magnetotransfection nrog kev xa tawm ntawm LV MP hauv vitro rau hauv cov kab ntawm tib neeg bronchial epithelium nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm ib qho chaw sib nqus zoo li qub tau tsim, ua kom muaj txiaj ntsig ntawm kev hloov pauv los ntawm 186 zaug piv nrog LV vector ib leeg.LV MT kuj tau siv rau hauv cov qauv hauv vitro ntawm cystic fibrosis, qhov chaw sib nqus hloov pauv tau nce LV hloov pauv hauv huab cua-kua sib txuas kab lis kev cai los ntawm ib qho ntawm 20 nyob rau hauv muaj cystic fibrosis sputum10.Txawm li cas los xij, hauv vivo lub cev muaj zog magnetotransfection tau txais kev saib xyuas me ntsis thiab tsuas yog raug soj ntsuam hauv qee qhov kev tshawb fawb tsiaj 11,12,13,14,15, tshwj xeeb tshaj yog nyob rau hauv lub ntsws16,17.Txawm li cas los xij, qhov muaj peev xwm ntawm kev sib nqus sib nqus hauv kev kho mob ntsws hauv cystic fibrosis yog qhov tseeb.Tan et al.(2020) tau hais tias "txoj kev tshawb fawb pom zoo ntawm kev xa cov kab mob pulmonary zoo ntawm cov hlau nplaum nanoparticles yuav ua rau txoj hauv kev rau yav tom ntej CFTR cov tswv yim nqus pa los txhim kho cov txiaj ntsig kho mob hauv cov neeg mob cystic fibrosis"6.
Tus cwj pwm ntawm cov khoom sib nqus me me nyob rau saum npoo ntawm cov hlab ntsws nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm daim ntawv thov magnetic teb yog qhov nyuaj rau kev pom thiab kawm, thiab yog li ntawd lawv tsis to taub.Hauv lwm cov kev tshawb fawb, peb tau tsim ib txoj kev Synchrotron Propagation Based Phase Contrast X-Ray Imaging (PB-PCXI) method for non-invasive imaging and quantification of feeb in vivo hloov hauv ASL18 qhov tob thiab MCT19 tus cwj pwm, 20 ncaj qha ntsuas roj channel nto hydration thiab yog siv los ua qhov qhia txog kev kho mob thaum ntxov.Tsis tas li ntawd, peb txoj kev ntsuas MCT siv 10-35 µm txoj kab uas hla uas muaj cov alumina lossis siab refractive index iav raws li MCT cov cim pom nrog PB-PCXI21.Ob txoj hauv kev yog tsim nyog rau kev yees duab ntau hom particle, suav nrog MPs.
Vim yog qhov kev daws teeb meem siab thiab lub cev, peb cov PB-PCXI-raws li ASL thiab MCT kev soj ntsuam zoo tsim nyog los kawm cov kev hloov pauv thiab kev coj tus cwj pwm ntawm ib leeg thiab cov khoom loj hauv vivo los pab peb nkag siab thiab txhim kho MP gene xa txoj kev.Txoj hauv kev uas peb siv ntawm no yog ua raws li peb cov kev tshawb fawb siv SPring-8 BL20B2 beamline, uas peb pom cov kua dej txav tom qab xa cov koob tshuaj dummy vector mus rau hauv lub qhov ntswg thiab pulmonary airways ntawm cov nas los pab piav qhia peb cov qauv ntawm cov noob caj noob ces tau pom. hauv peb cov gene.tsiaj kev tshawb fawb nrog ib tug cab kuj koob ntawm 3.4 .
Lub hom phiaj ntawm txoj kev tshawb no yog siv PB-PCXI synchrotron kom pom nyob rau hauv vivo txav ntawm ib tug series ntawm MPs nyob rau hauv lub trachea ntawm cov nas nyob.Cov kev tshawb fawb PB-PCXI no tau tsim los sim MP series, sib nqus lub zog, thiab qhov chaw los txiav txim lawv cov txiaj ntsig ntawm MP txav.Peb xav tias ib qho chaw sib nqus sab nraud yuav pab tau MF xa mus nyob lossis txav mus rau thaj chaw lub hom phiaj.Cov kev tshawb fawb no kuj tau tso cai rau peb los txiav txim cov hlau nplaum teeb tsa uas ua kom cov khoom seem tshuav nyob hauv lub trachea tom qab tso tawm.Hauv kev tshawb fawb thib ob, peb tsom mus siv qhov kev pom zoo no los ua kom pom cov qauv hloov pauv uas tshwm sim los ntawm vivo xa ntawm LV-MPs mus rau nas airways, ntawm qhov kev xav tias xa ntawm LV-MPs hauv cov ntsiab lus ntawm airway phiaj yuav tshwm sim. nyob rau hauv nce LV transduction efficiency..
Txhua qhov kev tshawb fawb tsiaj tau ua raws li cov txheej txheem pom zoo los ntawm University of Adelaide (M-2019-060 thiab M-2020-022) thiab SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee.Cov kev sim tau ua tiav raws li cov lus pom zoo ntawm ARRIVE.
Tag nrho cov duab x-ray raug coj los ntawm BL20XU beamline ntawm SPring-8 synchrotron hauv Nyij Pooj siv cov teeb tsa zoo ib yam li tau piav qhia yav dhau los 21,22.Luv luv, lub thawv sim tau nyob ntawm 245 m ntawm lub nplhaib synchrotron.Ib qho piv txwv-rau-ntaus deb ntawm 0.6 m yog siv rau kev tshawb fawb particle imaging thiab 0.3 m rau hauv vivo imaging kev tshawb fawb los tsim cov theem sib txawv.Ib tug monochromatic beam nrog lub zog ntawm 25 keV tau siv.Cov duab tau txais los ntawm kev siv lub siab daws teeb meem X-ray transducer (SPring-8 BM3) txuas rau sCMOS ntes.Lub transducer hloov X-rays rau pom lub teeb siv 10 µm tuab scintillator (Gd3Al2Ga3O12), uas yog tom qab ntawd coj mus rau sCMOS sensor siv lub hom phiaj × 10 (NA 0.3).Lub sCMOS ntes yog Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Nyiv) nrog qhov loj me ntawm 2048 × 2048 pixels thiab cov pixel loj ntawm 6.5 × 6.5 µm.Qhov kev teeb tsa no muab qhov zoo ntawm isotropic pixel loj ntawm 0.51 µm thiab thaj chaw pom ntawm kwv yees li 1.1 hli × 1.1 hli.Lub sijhawm raug ntawm 100 ms tau raug xaiv los ua kom pom qhov sib nqus-rau-lub suab sib piv ntawm cov khoom sib nqus sab hauv thiab sab nraud ntawm txoj hlab pa thaum txo qis cov khoom cuav los ntawm kev ua pa.Rau hauv vivo cov kev tshawb fawb, lub kaw lus xoo hluav taws xob ceev tau muab tso rau hauv txoj kev X-ray kom txwv tsis pub siv hluav taws xob los ntawm kev thaiv cov kab hluav taws xob X-ray ntawm qhov raug.
LV media tsis tau siv rau hauv ib qho kev tshawb fawb SPring-8 PB-PCXI vim tias BL20XU imaging chamber tsis yog Biosafety Level 2 tau ntawv pov thawj.Hloov chaw, peb tau xaiv ntau yam MPs uas muaj tus cwj pwm zoo los ntawm ob tus neeg muag khoom lag luam uas suav nrog ntau qhov ntau thiab tsawg, cov ntaub ntawv, cov khoom siv hlau, thiab cov ntawv thov, - ua ntej kom nkag siab tias thaj chaw sib nqus cuam tshuam li cas rau kev txav ntawm MPs hauv iav capillaries, thiab tom qab ntawd hauv nyob airways.nto.Qhov loj ntawm MP nws txawv ntawm 0.25 mus rau 18 µm thiab yog tsim los ntawm ntau yam ntaub ntawv (saib Table 1), tab sis qhov muaj pes tsawg leeg ntawm txhua tus qauv, nrog rau qhov loj ntawm cov hlau nplaum nyob hauv MP, tsis paub.Raws li peb cov kev tshawb fawb MCT uas nws kim heev 19, 20, 21, 23, 24, peb cia siab tias MPs mus txog 5 µm tuaj yeem pom ntawm qhov chaw ntawm txoj hlab ntsws, piv txwv li, los ntawm kev rho tawm sib law liag kom pom kev pom kev zoo dua ntawm MP.Ib qho MP ntawm 0.25 µm yog me dua qhov kev daws teeb meem ntawm cov khoom siv duab, tab sis PB-PCXI yuav tsum pom lawv qhov sib txawv ntawm qhov sib txawv thiab qhov txav ntawm cov kua dej uas lawv tau tso tom qab tso.
Cov qauv rau txhua tus MP hauv lub rooj.1 tau npaj nyob rau hauv 20 μl iav capillaries (Drummond Microcaps, PA, USA) nrog ib txoj kab uas hla ntawm 0.63 hli.Corpuscular particles muaj nyob rau hauv dej, thaum CombiMag hais muaj nyob rau hauv cov chaw tsim tshuaj paus cov kua.Txhua lub raj yog ib nrab ntim nrog cov kua (kwv yees li 11 µl) thiab muab tso rau ntawm tus qauv tuav (saib daim duab 1).Cov iav capillaries tau muab tso rau hauv kab rov tav rau ntawm theem hauv chav duab duab, raws li, thiab muab tso rau ntawm cov npoo ntawm cov kua.Ib txoj kab uas hla 19 hli (28 hli ntev) npib tsib xee-plhaub hlau nplaum ua los ntawm lub ntiaj teb tsis tshua muaj, neodymium, hlau thiab boron (NdFeB) (N35, cat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) nrog ib tug remanence ntawm 1.17 T tau txuas mus rau ib tug cais cov lus hloov mus ua kom tiav Remotely hloov koj txoj hauj lwm thaum rendering.X-ray imaging pib thaum cov hlau nplaum nyob ze li ntawm 30 mm saum cov qauv thiab cov duab tau txais ntawm 4 thav duab ib ob.Thaum lub sij hawm kev yees duab, cov hlau nplaum tau coj los ze rau lub iav capillary raj (ntawm qhov deb li ntawm 1 hli) thiab tom qab ntawd txav mus rau hauv lub raj los ntsuas qhov cuam tshuam ntawm lub zog thiab txoj hauj lwm.
Ib qho kev teeb tsa hauv vitro uas muaj MP cov qauv hauv cov iav capillaries ntawm theem ntawm kev txhais cov qauv xy.Txoj kev ntawm X-ray beam yog cim nrog ib tug liab dotted kab.
Thaum qhov pom kev hauv vitro ntawm MPs tau tsim, ib qho ntawm lawv tau sim hauv vivo ntawm cov tsiaj qus Wistar albino nas (~ 12 lub lis piam, ~ 200 g).Medetomidine 0.24 mg/kg (Domitor®, Zenoaq, Nyiv), midazolam 3.2 mg/kg (Dormicum®, Astellas Pharma, Nyiv) thiab butorphanol 4 mg/kg (Vetorphale®, Meiji Seika).Cov nas tsuag tau tshuaj loog nrog Pharma (Nyiv) sib tov los ntawm kev txhaj tshuaj intraperitoneal.Tom qab tshuaj loog, lawv tau npaj rau kev tshuaj xyuas los ntawm kev tshem tawm cov plaub nyob ib ncig ntawm lub trachea, ntxig ib lub raj endotracheal (ET; 16 Ga intravenous cannula, Terumo BCT), thiab immobilizing lawv nyob rau hauv lub supine txoj hauj lwm ntawm ib tug custom-made imaging phaj uas muaj ib tug thermal hnab. tswj lub cev kub.22. Cov duab thaij duab tau txuas mus rau cov qauv theem hauv lub npov duab ntawm lub kaum sab xis me ntsis txhawm rau txhawm rau txhawm rau txhawm rau txhawm rau kab rov tav ntawm daim duab x-ray raws li pom hauv daim duab 2a.
(a) Nyob rau hauv vivo imaging teeb nyob rau hauv SPring-8 imaging unit, X-ray beam txoj kev cim nrog liab dotted kab.(b, c) Tracheal magnet localization tau ua nyob deb ntawm ob lub koob yees duab IP uas tau teeb tsa.Nyob rau sab laug ntawm daim duab ntawm qhov screen, koj tuaj yeem pom cov hlua hlau tuav lub taub hau thiab xa cov cannula ntsia hauv ET raj.
Ib lub twj tso kua mis tswj chaw taws teeb (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) siv 100 µl iav syringe tau txuas nrog PE10 tubing (0.61 mm OD, 0.28 mm ID) siv 30 Ga koob.Kos lub raj kom paub meej tias qhov ntxeev yog nyob rau hauv qhov tseeb ntawm lub trachea thaum muab lub raj endotracheal.Siv lub micropump, lub syringe plunger raug tshem tawm thiab lub hau ntawm lub raj tau muab tso rau hauv MP qauv kom xa.Lub raj xa khoom thauj khoom tau muab tso rau hauv lub raj endotracheal, muab cov lus taw qhia ntawm qhov muaj zog tshaj plaws ntawm peb qhov kev xav tau siv hlau nplaum.Cov duab nrhiav tau raug tswj los ntawm kev siv lub tshuab nqus pa txuas nrog peb lub sijhawm Arduino-raws li lub sijhawm, thiab tag nrho cov teeb liab (xws li, qhov kub thiab txias, kev ua pa, qhov qhib / kaw, thiab cov duab tau txais) tau sau tseg siv Powerlab thiab LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 Thaum Kev Ntsuas Thaum lub vaj tse tsis muaj, ob lub koob yees duab IP (Panasonic BB-SC382) tau muab tso rau ntawm kwv yees li 90 ° rau ib leeg thiab siv los tswj txoj hauj lwm ntawm cov hlau nplaum txheeb ze rau lub trachea thaum ua duab (Daim duab 2b, c).Txhawm rau txo qis cov khoom siv dag zog, ib daim duab ntawm ib qho pa tau txais thaum lub sijhawm ua pa ntawm cov pa hauv toj siab.
Cov hlau nplaum txuas mus rau theem ob, uas tuaj yeem nyob deb ntawm sab nraud ntawm lub cev duab.Ntau txoj haujlwm thiab kev teeb tsa ntawm cov hlau nplaum tau sim, suav nrog: muab tso rau ntawm lub kaum sab xis ntawm kwv yees li 30 ° saum lub trachea (kev teeb tsa tau pom hauv daim duab 2a thiab 3a);ib lub hlau nplaum saum tus tsiaj thiab lwm yam hauv qab no, nrog rau cov ncej teem rau kev nyiam (Daim duab 3b)., ib lub hlau nplaum saum tus tsiaj thiab ib qho hauv qab, nrog rau cov ncej teem rau repulsion (Daim duab 3c), thiab ib lub hlau nplaum saum toj no thiab perpendicular mus rau trachea (Daim duab 3d).Tom qab teeb tsa tus tsiaj thiab hlau nplaum thiab thauj MP hauv kev sim rau hauv lub twj tso kua mis, xa ib koob ntawm 50 µl ntawm tus nqi ntawm 4 µl / sec thaum tau txais cov duab.Cov hlau nplaum yog tom qab ntawd txav mus rau sab nraud los yog hla lub trachea thaum txuas ntxiv kom tau txais cov duab.
Magnet configuration rau hauv vivo imaging (a) ib lub hlau nplaum saum lub trachea ntawm lub kaum sab xis ntawm kwv yees li 30 °, (b) ob lub hlau nplaum teeb tsa rau kev nyiam, (c) ob lub hlau nplaum teeb tsa rau repulsion, (d) ib lub hlau nplaum saum toj no thiab perpendicular rau trachea.Tus neeg soj ntsuam saib nqes los ntawm lub qhov ncauj mus rau lub ntsws los ntawm lub trachea thiab lub X-ray beam hla mus rau sab laug ntawm tus nas thiab tawm sab xis.Cov hlau nplaum yog txav raws qhov ntev ntawm txoj hlab pa los yog sab laug thiab sab xis saum lub trachea nyob rau hauv kev coj ntawm X-ray beam.
Peb kuj tau nrhiav kev txiav txim siab qhov pom thiab tus cwj pwm ntawm cov khoom hauv cov pa hauv qhov tsis muaj kev sib xyaw ua pa thiab lub plawv dhia.Yog li ntawd, thaum kawg ntawm lub sij hawm imaging, tsiaj tau humanely euthanized vim pentobarbital overdose (Somnopentyl, Pitman-Moore, Washington Hla, USA; ~ 65 mg / kg ip).Qee cov tsiaj tau tso rau ntawm lub platform duab, thiab tom qab kev ua pa thiab lub plawv dhia, cov txheej txheem rov ua dua, ntxiv cov tshuaj MP ntxiv yog tias tsis muaj MP pom nyob rau ntawm txoj hlab pa.
Cov duab tshwm sim tau raug kho rau thaj chaw tiaj thiab tsaus thiab tom qab ntawd sib sau ua yeeb yaj kiab (20 thav ntawv ib ob; 15–25 × ib txwm ceev nyob ntawm tus nqi ua pa) siv cov ntawv sau hauv MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Tag nrho cov kev tshawb fawb ntawm LV gene vector xa khoom tau ua nyob rau hauv University of Adelaide Laboratory Tsiaj Research Center thiab tsom siv cov txiaj ntsig ntawm SPring-8 kev sim los ntsuam xyuas seb LV-MP tus me nyuam nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm magnetic teb tuaj yeem txhim kho cov noob hloov hauv vivo. .Txhawm rau ntsuas qhov cuam tshuam ntawm MF thiab magnetic teb, ob pawg tsiaj raug kho: ib pawg tau txhaj LV MF nrog cov hlau nplaum tso, thiab lwm pab pawg tau txhaj tshuaj nrog pawg tswj hwm nrog LV MF yam tsis muaj hlau nplaum.
LV gene vectors tau tsim los siv cov kev piav qhia yav dhau los 25, 26 .Lub LacZ vector qhia txog cov noob qoob loo hauv zos beta-galactosidase uas tau tsav los ntawm MPSV cov neeg txhawb nqa (LV-LacZ), uas tsim cov tshuaj tiv thaiv xiav hauv cov hlwb hloov pauv, pom ntawm sab xub ntiag thiab ntu ntawm lub ntsws.Titration tau ua nyob rau hauv cov kab lis kev cai ntawm tes los ntawm kev suav tus lej ntawm LacZ-zoo hlwb siv lub hemocytometer los xam cov titer hauv TU / ml.Cov neeg nqa khoom tau khaws cia ntawm -80 ° C, thawed ua ntej siv, thiab khi rau CombiMag los ntawm kev sib xyaw 1: 1 thiab incubating rau dej khov rau yam tsawg 30 feeb ua ntej xa khoom.
Ib txwm Sprague Dawley nas (n = 3 / pab pawg, ~ 2-3 tshuaj loog ip nrog kev sib xyaw ntawm 0.4mg / kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) thiab 60mg / kg ketamine (Ilium, Australia) thaum muaj hnub nyoog 1 hli) ip ) txhaj tshuaj thiab tsis yog phais qhov ncauj cannulation nrog 16 Ga intravenous cannula.Txhawm rau kom ntseeg tau tias cov ntaub so ntswg tracheal tau txais LV transduction, nws tau txias siv peb cov txheej txheem yav dhau los tau piav qhia txog kev cuam tshuam ntawm cov hlab ntsha hauv qhov chaw uas cov hlab ntsws tau rubbed axially nrog lub pob tawb xaim (N-Circle, nitinol pob zeb extractor yam tsis muaj cov lus qhia NTSE-022115) -UDH , Cook Medical, USA) 30 p28.Tom qab ntawd, kwv yees li 10 feeb tom qab muaj kev cuam tshuam hauv lub txee biosafety, kev tswj hwm tracheal ntawm LV-MP tau ua.
Cov hlau nplaum siv hauv qhov kev sim no tau teeb tsa zoo ib yam li kev kawm hauv vivo x-ray, nrog tib cov hlau nplaum tuav hla lub trachea nrog distillation stent clamps (Daim duab 4).Ib 50 µl ntim (2 x 25 µl aliquots) ntawm LV-MP tau xa mus rau trachea (n = 3 tsiaj) siv lub gel-tipped pipette raws li tau piav qhia dhau los.Pawg tswj hwm (n = 3 tsiaj) tau txais tib yam LV-MP yam tsis siv cov hlau nplaum.Tom qab ua tiav ntawm qhov infusion, lub cannula raug tshem tawm ntawm lub raj endotracheal thiab tus tsiaj raug extubated.Cov hlau nplaum tseem nyob hauv qhov chaw rau 10 feeb ua ntej muab tshem tawm.Cov nas tsuag tau txhaj tshuaj subcutaneously nrog meloxicam (1 ml / kg) (Ilium, Australia) ua raws li kev siv tshuaj loog tshem tawm los ntawm kev txhaj tshuaj intraperitoneal ntawm 1 mg / kg atipamazole hydrochloride (Antisedan, Zoetis, Australia).Cov nas tau khaws cia sov thiab saib xyuas kom txog thaum rov ua tiav los ntawm kev siv tshuaj loog.
LV-MP cov khoom xa tuaj hauv lub txee kev nyab xeeb.Koj tuaj yeem pom tias lub teeb grey Luer-lock lub tes tsho ntawm ET raj protrudes los ntawm lub qhov ncauj, thiab cov gel pipette taub hau qhia hauv daim duab yog ntxig los ntawm ET raj mus rau qhov xav tau qhov tob rau hauv lub raj.
Ib lub lim tiam tom qab LV-MP cov txheej txheem tswj hwm, cov tsiaj txhu tau muab txi rau tib neeg los ntawm kev nqus ntawm 100% CO2 thiab LacZ qhia tau raug soj ntsuam siv peb cov kev kho mob X-gal.Peb feem ntau cov pob txha pob txha pob txha raug tshem tawm kom ntseeg tau tias txhua yam kev puas tsuaj lossis cov kua dej khaws cia vim qhov kev tso kawm ntawm cov raj endotracheal yuav tsis suav nrog hauv kev tshuaj xyuas.Txhua trachea raug txiav lengthwise kom tau ob halves rau kev tsom xam thiab muab tso rau hauv ib lub khob uas muaj silicone roj hmab (Sylgard, Dow Inc) siv ib rab koob Minutien (Fine Science Tools) kom pom lub luminal nto.Kev faib tawm thiab tus cwj pwm ntawm cov hlwb hloov tau raug lees paub los ntawm kev yees duab pem hauv ntej siv Nikon microscope (SMZ1500) nrog lub koob yees duab DigiLite thiab TCapture software (Tucsen Photonics, Suav).Cov duab tau txais ntawm 20x magnification (nrog rau qhov chaw siab tshaj plaws rau tag nrho qhov dav ntawm lub trachea), nrog rau tag nrho qhov ntev ntawm lub trachea tso tawm cov kauj ruam los ntawm kauj ruam, muab kev sib tshooj txaus ntawm txhua daim duab kom tso cai rau cov duab "stitched".Cov duab los ntawm txhua lub trachea tau muab tso ua ke rau hauv ib qho duab sib xyaw siv Composite Image Editor version 2.0.3 (Microsoft Research) siv cov phiaj xwm kev taw qhia algorithm. Lub cheeb tsam ntawm LacZ qhia nyob rau hauv cov duab sib xyaw ntawm tracheal composite los ntawm txhua tus tsiaj tau suav nrog siv MATLAB tsab ntawv automated (R2020a, MathWorks) raws li tau piav qhia dhau los 28, siv qhov chaw ntawm 0.35 < Hau < 0.58, Saturation> 0.15, thiab Tus Nqi < 0.7. Lub cheeb tsam ntawm LacZ qhia nyob rau hauv cov duab tracheal composite los ntawm txhua tus tsiaj tau suav nrog siv MATLAB tsab ntawv automated (R2020a, MathWorks) raws li tau piav qhia yav dhau los 28, siv qhov chaw ntawm 0.35 <Hue < 0.58, Saturation> 0.15, thiab Tus nqi <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ,7 ib. Lub cheeb tsam ntawm LacZ qhia nyob rau hauv cov tracheal duab sib xyaw los ntawm txhua tus tsiaj tau suav nrog siv MATLAB automated tsab ntawv (R2020a, MathWorks) raws li yav dhau los tau piav qhia 28 siv qhov chaw ntawm 0.350.15 thiab tus nqi <0.7.前所 前所 述, 使用 自动 Matlab 脚本 (r2020a, ua lej) 对 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 区域 的 区域 色调 色调, 使用 <色调 <0.15 和值 <0.7 和值 <0.7 的.前所 前所 述, 自动 自动 Matlab 脚本 ((R2020A, Lej-的 每 每每 的只 复合只 的气管 复合气管 复合的 复合的 复合的 复合量化 量化量化 量化量化 量化, 使用 色调 <0..15 和值 <0.7 的 ..... . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . Cov cheeb tsam ntawm LacZ qhia txog cov duab sib xyaw ntawm lub trachea ntawm txhua tus tsiaj tau suav nrog siv MATLAB tsab ntawv automated (R2020a, MathWorks) raws li tau piav qhia dhau los siv cov chaw ntawm 0.35 < hue < 0.58, saturation> 0.15 thiab tus nqi <0.7.Los ntawm kev taug qab cov ntaub so ntswg contours hauv GIMP v2.10.24, lub npog ntsej muag tau tsim los ntawm tes rau txhua daim duab sib xyaw kom paub cov ntaub so ntswg thiab tiv thaiv kev kuaj pom tsis tseeb sab nraum cov ntaub so ntswg.Cov chaw stained los ntawm tag nrho cov duab sib xyaw los ntawm txhua tus tsiaj tau sau tseg kom muab tag nrho thaj chaw stained rau tus tsiaj ntawd.Cov xim pleev xim rau tom qab ntawd muab faib los ntawm tag nrho cheeb tsam ntawm daim npog ntsej muag kom tau txais thaj chaw zoo li qub.
Txhua lub trachea tau muab tso rau hauv paraffin thiab ntu 5 µm tuab.Cov ntu tau suav nrog qhov nruab nrab nrawm nrawm rau 5 feeb thiab cov duab tau txais los ntawm Nikon Eclipse E400 microscope, DS-Fi3 lub koob yees duab thiab NIS lub caij ntes software (version 5.20.00).
Txhua qhov kev txheeb cais tau ua tiav hauv GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.).Kev txheeb xyuas qhov tseem ceeb tau teeb tsa ntawm p ≤ 0.05.Qhov zoo li qub tau sim siv Shapiro-Wilk kev sim thiab qhov sib txawv ntawm LacZ staining tau raug soj ntsuam siv qhov tsis sib xws t-test.
Lub rau MPs uas tau piav qhia hauv Table 1 tau kuaj xyuas los ntawm PCXI, thiab qhov pom tau tau piav qhia hauv Table 2. Ob lub polystyrene MPs (MP1 thiab MP2; 18 µm thiab 0.25 µm, ntsig txog) tsis pom los ntawm PCXI, tab sis cov qauv ntxiv tuaj yeem txheeb xyuas. (Piv txwv yog qhia hauv daim duab 5).MP3 thiab MP4 pom tsis muaj zog (10-15% Fe3O4; 0.25 µm thiab 0.9 µm, feem).Txawm hais tias MP5 (98% Fe3O4; 0.25 µm) muaj qee qhov me me uas tau sim, nws yog qhov tshaj tawm.Cov khoom CombiMag MP6 yog qhov nyuaj rau kev paub qhov txawv.Nyob rau hauv txhua rooj plaub, peb lub peev xwm los ntes MFs tau txhim kho zoo heev los ntawm kev txav cov hlau nplaum rov qab mus rau qhov sib npaug mus rau lub capillary.Raws li cov hlau nplaum txav deb ntawm lub capillary, cov khoom raug rub tawm hauv cov hlua ntev, tab sis raws li cov hlau nplaum los ze zog thiab cov hlau nplaum muaj zog ntxiv, cov hlua txuas luv luv vim tias cov khoom txav mus rau sab sauv ntawm cov hlab ntsha (saib Ntxiv Video S1 : MP4), nce particle ceev ntawm qhov chaw.Hloov pauv, thaum cov hlau nplaum raug tshem tawm ntawm lub capillary, lub zog teb txo qis thiab cov MPs rov ua dua rau hauv cov hlua ntev ntev los ntawm sab saud ntawm cov hlab ntsha (saib Ntxiv Video S2: MP4).Tom qab cov hlau nplaum tsis txav mus, cov khoom txuas ntxiv mus rau qee lub sijhawm tom qab ncav cuag qhov sib npaug.Raws li MP txav mus rau thiab deb ntawm sab sauv ntawm capillary, cov khoom sib nqus zoo li kos cov khib nyiab los ntawm cov kua.
Qhov pom ntawm MP nyob rau hauv PCXI sib txawv heev ntawm cov qauv.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 thiab (d) MP6.Tag nrho cov duab qhia ntawm no tau raug coj los nrog cov hlau nplaum nyob ze li 10 mm ncaj qha saum lub capillary.Lub voj voog loj uas pom tseeb yog cov npuas huab cua uas nyob hauv cov hlab ntsha, qhia meej txog cov ntug dub thiab dawb ntawm cov duab sib piv.Lub thawv liab qhia qhov kev nthuav dav uas txhim kho qhov sib txawv.Nco ntsoov tias lub diameters ntawm cov hlau nplaum circuits nyob rau hauv tag nrho cov duab tsis yog scale thiab yog kwv yees li 100 lub sij hawm loj dua li qhia.
Raws li cov hlau nplaum txav mus rau sab laug thiab sab xis nyob rau sab saum toj ntawm lub capillary, lub kaum sab xis ntawm MP txoj hlua hloov mus ua ke nrog cov hlau nplaum (saib daim duab 6), yog li delineating cov kab hlau nplaum.Rau MP3-5, tom qab lub chord ncav cuag lub kaum sab xis, cov khoom xa mus rau sab sauv ntawm lub capillary.Qhov no feem ntau ua rau MPs pawg ua pawg loj nyob ze qhov chaw sib nqus muaj zog tshaj plaws (saib Ntxiv Video S3: MP5).Qhov no kuj tseem ceeb tshwj xeeb tshaj yog thaum kev yees duab ze rau qhov kawg ntawm lub capillary, uas ua rau MP kom sib sau thiab mloog zoo ntawm cov kua-cua interface.Cov khoom hauv MP6, uas nyuaj rau qhov txawv dua li cov hauv MP3-5, tsis rub thaum cov hlau nplaum txav raws cov hlab ntsha, tab sis cov MP cov hlua dissociated, tawm hauv qhov pom (saib Ntxiv Video S4: MP6).Qee qhov xwm txheej, thaum cov hlau nplaum siv tau raug txo los ntawm kev txav cov hlau nplaum ntev ntev los ntawm qhov chaw thaij duab, cov MPs tseem tshuav maj mam nqis mus rau hauv qab ntawm lub raj los ntawm lub ntiajteb txawj nqus, nyob rau hauv txoj hlua (saib Ntxiv Video S5: MP3) .
Lub kaum sab xis ntawm MP hlua hloov raws li cov hlau nplaum txav mus rau sab xis saum lub capillary.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 thiab (d) MP6.Lub thawv liab qhia qhov kev nthuav dav uas txhim kho qhov sib txawv.Thov nco ntsoov tias cov yeeb yaj kiab ntxiv yog rau cov ntaub ntawv xov xwm vim lawv nthuav tawm cov qauv tseem ceeb thiab cov ntaub ntawv muaj zog uas tsis tuaj yeem pom hauv cov duab zoo li no.
Peb cov kev ntsuam xyuas tau pom tias kev txav cov hlau nplaum rov qab thiab maj mam nyob ntawm lub trachea ua kom pom kev pom ntawm MF nyob rau hauv cov ntsiab lus ntawm txoj kev txav hauv vivo.Tsis muaj nyob rau hauv vivo xeem tau ua vim hais tias cov hlaws polystyrene (MP1 thiab MP2) tsis pom nyob rau hauv capillary.Txhua ntawm plaub MFs ntxiv tau raug sim hauv vivo nrog lub axis ntev ntawm cov hlau nplaum tso rau ntawm lub trachea ntawm lub kaum sab xis ntawm 30 ° mus rau ntsug (saib daim duab 2b thiab 3a), vim qhov no ua rau ntev MF chains thiab ua tau zoo dua. tshaj ib tug hlau nplaum..configuration xaus.MP3, MP4 thiab MP6 tsis tau pom nyob rau hauv lub trachea ntawm tej tsiaj nyob.Thaum pom cov kab mob ua pa ntawm nas tom qab tib neeg tua tsiaj, cov khoom tseem tsis pom txawm tias ntxiv ntim ntxiv siv lub twj tso kua mis.MP5 muaj cov ntsiab lus ntawm cov hlau oxide siab tshaj plaws thiab tsuas yog pom cov khoom, yog li nws tau siv los ntsuas thiab ua tus cwj pwm MP hauv vivo.
Qhov chaw ntawm cov hlau nplaum hla lub trachea thaum lub sij hawm MF insertion ua rau ntau, tab sis tsis yog tag nrho, MFs tau concentrated nyob rau hauv qhov kev pom.Tracheal nkag ntawm cov khoom yog pom zoo nyob rau hauv humanely euthanized tsiaj.Daim duab 7 thiab Ntxiv Video S6: MP5 qhia tau ceev nrooj sib nqus thiab sib dhos ntawm cov khoom nyob rau ntawm qhov chaw ntawm lub trachea, qhia tias MPs tuaj yeem raug tsom mus rau thaj chaw uas xav tau ntawm lub trachea.Thaum tshawb nrhiav ntau dua nyob rau hauv lub trachea tom qab MF xa khoom, qee qhov MFs tau pom nyob ze rau carina, uas qhia tias tsis muaj peev xwm sib nqus lub zog los khaws thiab tuav tag nrho MFs, txij li thaum lawv tau xa los ntawm thaj tsam ntawm qhov siab tshaj plaws magnetic teb lub zog thaum lub sij hawm tswj dej.txheej txheem.Txawm li cas los xij, tom qab yug me nyuam MP ntau dua nyob ib puag ncig daim duab, qhia tias ntau tus MPs tseem nyob hauv thaj chaw ua pa uas siv cov hlau nplaum siv zog siab tshaj plaws.
Cov duab ntawm (a) ua ntej thiab (b) tom qab xa MP5 mus rau hauv lub trachea ntawm ib tug nas nyuam qhuav euthanized nrog ib tug hlau nplaum tso rau saum toj no cov duab.Cov duab piav qhia yog nyob nruab nrab ntawm ob lub nplhaib cartilaginous.Muaj qee cov kua dej hauv txoj hlab pa ua ntej MP xa.Lub thawv liab qhia qhov kev nthuav dav uas txhim kho qhov sib txawv.Cov duab no yog coj los ntawm cov yeeb yaj kiab uas muaj nyob hauv S6: MP5 Ntxiv Video.
Tsiv cov hlau nplaum raws lub trachea hauv vivo ua rau muaj kev hloov pauv ntawm lub kaum sab xis ntawm MP saw ntawm cov pa hauv pa, zoo ib yam li qhov pom hauv capillaries (saib daim duab 8 thiab Ntxiv Video S7: MP5).Txawm li cas los xij, hauv peb txoj kev tshawb fawb, MPs tsis tuaj yeem raug rub los ntawm cov kab mob ua pa, raws li cov hlab ntsha tuaj yeem ua tau.Qee zaum, MP chain lengthens li cov hlau nplaum txav sab laug thiab sab xis.Interestingly, peb kuj pom tias cov particle saw hloov qhov tob ntawm txheej txheej ntawm cov kua dej thaum cov hlau nplaum tsiv longitudinally raws lub trachea, thiab nthuav thaum cov hlau nplaum tsiv ncaj qha mus rau saum taub hau thiab particle saw yog tig mus rau ib txoj hauj lwm ntsug (saib Ntxiv Video S7).: MP5 ntawm 0:09, hauv qab sab xis).Tus cwj pwm txav txav tau hloov pauv thaum cov hlau nplaum tau txav mus rau sab saum toj ntawm lub trachea (piv txwv li, mus rau sab laug lossis sab xis ntawm tus tsiaj, tsis yog raws li qhov ntev ntawm lub trachea).Cov khoom tseem pom tau meej meej thaum lawv txav mus los, tab sis thaum cov hlau nplaum raug tshem tawm ntawm lub trachea, cov lus qhia ntawm cov hlua particle tau pom (saib Ntxiv Video S8: MP5, pib ntawm 0:08).Qhov no pom zoo nrog kev pom tus cwj pwm ntawm cov magnetic teb nyob rau hauv qhov kev txiav txim ntawm ib daim ntawv thov magnetic teb nyob rau hauv lub iav capillary.
Cov duab piv txwv qhia MP5 nyob rau hauv lub trachea ntawm ib tug nyob anesthetized nas.(a) Cov hlau nplaum yog siv los ua kom tau cov duab saum toj no thiab sab laug ntawm lub trachea, ces (b) tom qab txav cov hlau nplaum mus rau sab xis.Lub thawv liab qhia qhov kev nthuav dav uas txhim kho qhov sib txawv.Cov duab no yog los ntawm cov yees duab featured hauv S7's Ntxiv Video: MP5.
Thaum ob tug ncej tau kho nyob rau sab qaum teb-sab qab teb orientation saum toj no thiab hauv qab lub trachea (piv txwv li, attracting; Fig. 3b), MP chords tau tshwm sim ntev dua thiab nyob rau ntawm phab ntsa ntawm lub trachea es tsis yog ntawm lub dorsal nto ntawm lub trachea (saib daim ntawv ntxiv).Video S9:MP5).Txawm li cas los xij, cov ntsiab lus siab ntawm ib qhov chaw (piv txwv li, qhov chaw dorsal ntawm lub trachea) tsis tau kuaj pom tom qab kev tswj hwm cov dej siv cov khoom siv hlau nplaum dual, uas feem ntau tshwm sim nrog ib qho khoom siv hlau nplaum.Tom qab ntawd, thaum ib lub hlau nplaum tau teeb tsa los tiv thaiv cov ncej sab nraud (Daim duab 3c), tus naj npawb ntawm cov khoom pom hauv qhov pom tsis tau nce ntxiv tom qab xa khoom.Kev teeb tsa ob qho tib si hlau nplaum teeb tsa yog qhov nyuaj vim qhov siab sib nqus lub zog uas nyiam los yog thawb cov hlau nplaum raws li.Kev teeb tsa tau raug hloov mus rau ib qho hlau nplaum sib npaug rau cov hlab cua tab sis dhau los ntawm cov hlab cua ntawm 90 degree lub kaum sab xis kom cov kab ntawm lub zog hla lub tracheal phab ntsa orthogonally (Daim duab 3d), ib qho kev taw qhia los txiav txim siab qhov ua tau ntawm particle aggregation ntawm phab ntsa sab nraud.raug soj ntsuam.Txawm li cas los xij, hauv qhov kev teeb tsa no, tsis muaj kev txheeb xyuas MF accumululation txav lossis hlau nplaum txav.Raws li tag nrho cov txiaj ntsig no, ib qho kev teeb tsa nrog ib qho hlau nplaum thiab 30-degree orientation raug xaiv rau hauv vivo kev tshawb fawb ntawm cov neeg nqa khoom (Fig. 3a).
Thaum tus tsiaj tau pom ntau zaus tam sim ntawd tom qab kev txi tib neeg, qhov tsis muaj kev cuam tshuam cov ntaub so ntswg txav txhais tau hais tias cov kab me me, cov kab me me tuaj yeem pom nyob rau hauv qhov ntshiab intercartilaginous teb, 'swaying' raws li kev txhais lus ntawm cov hlau nplaum.kom meej meej pom lub xub ntiag thiab txav ntawm MP6 hais.
Lub titer ntawm LV-LacZ yog 1.8 x 108 IU / mL, thiab tom qab sib tov 1: 1 nrog CombiMag MP (MP6), tsiaj raug txhaj nrog 50 µl ntawm tracheal koob tshuaj 9 x 107 IU / ml ntawm LV tsheb (xws li 4.5. x 106 TU/rat).)).Nyob rau hauv cov kev tshawb fawb no, es tsis txhob txav cov hlau nplaum thaum lub sij hawm ua hauj lwm, peb kho cov hlau nplaum nyob rau hauv ib txoj hauj lwm los txiav txim seb LV transduction puas tuaj yeem (a) zoo dua piv rau kev xa khoom hauv vector tsis muaj qhov sib nqus, thiab (b) yog tias txoj hlab pa tuaj yeem ua kom pom tseeb.Cov hlwb raug transduced nyob rau hauv lub magnetic hom phiaj ntawm lub Upper pa ib ntsuj av.
Lub xub ntiag ntawm cov hlau nplaum thiab kev siv CombiMag ua ke nrog LV vectors tsis tshwm sim ua rau muaj kev cuam tshuam rau tsiaj noj qab haus huv, raws li peb tus qauv LV vector xa khoom raws tu qauv.Frontal dluab ntawm cheeb tsam tracheal raug rau cov neeg kho tshuab perturbation (Ntxiv daim duab 1) qhia tau hais tias cov pab pawg neeg kho LV-MP muaj ntau dua kev hloov nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm ib tug hlau nplaum (Fig. 9a).Tsuas yog ib qho me me ntawm xiav LacZ staining nyob rau hauv pawg tswj hwm (Daim duab 9b).Kev suav ntawm X-Gal-stained cov cheeb tsam ib txwm pom tau hais tias kev tswj hwm ntawm LV-MP nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm cov hlau nplaum ua rau muaj kev txhim kho kwv yees li 6 npaug (Daim duab 9c).
Piv txwv ntawm cov duab sib xyaw uas qhia txog kev hloov pauv hauv lub cev nrog LV-MP (a) nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm cov hlau nplaum thiab (b) thaum tsis muaj hlau nplaum.(c) Kev txhim kho tseem ceeb hauv thaj tsam li qub ntawm LacZ kev hloov pauv hauv lub trachea nrog kev siv cov hlau nplaum (* p = 0.029, t-test, n = 3 rau ib pawg, txhais tau tias ± tus qauv yuam kev ntawm qhov txhais tau tias).
Qhov nruab nrab ceev liab-stained seem (piv txwv nyob rau hauv Ntxiv Fig. 2) qhia tias LacZ-stained hlwb muaj nyob rau hauv tib tus qauv thiab nyob rau hauv tib qhov chaw raws li yav tas los qhia.
Qhov kev sib tw tseem ceeb hauv txoj kev kho cov noob caj noob ces tseem yog qhov tseeb hauv cheeb tsam ntawm cov khoom nqa khoom hauv thaj chaw txaus siab thiab kev ua tiav ntawm qib siab ntawm kev hloov pauv kev ua haujlwm hauv lub ntsws ntawm lub ntsws nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm airflow thiab active mucus clearance.Rau LV cov neeg nqa khoom npaj rau kev kho mob ntawm cov kab mob ua pa hauv cystic fibrosis, ua rau lub sijhawm nyob ntawm cov khoom nqa khoom hauv cov pa hauv cov hlab ntsha tau tam sim no yog lub hom phiaj tsis tuaj yeem ua tiav.Raws li tau taw qhia los ntawm Castellani li al., kev siv cov hlau nplaum sib nqus los txhim kho kev hloov pauv tau zoo dua lwm txoj hauv kev xa cov noob xws li electroporation vim tias nws tuaj yeem ua ke yooj yim, kev lag luam, xa khoom hauv zos, nce kev ua tau zoo, thiab lub sijhawm luv luv.thiab tejzaum nws txo koob tshuaj tsheb 10.Txawm li cas los xij, nyob rau hauv vivo deposition thiab tus cwj pwm ntawm cov hlau nplaum nyob rau hauv cov hlab cua nyob rau hauv lub zog ntawm sab nraud magnetic rog yeej tsis tau piav qhia, thiab qhov tseeb lub peev xwm ntawm txoj kev no yuav ua rau kom nce qib ntawm cov noob nyob rau hauv cov hlab ntsha nyob tsis tau pom nyob rau hauv vivo.
Peb qhov kev sim hauv vitro ntawm PCXI synchrotron tau pom tias tag nrho cov khoom peb tau sim, tshwj tsis yog MP polystyrene, tau pom hauv cov duab teeb tsa peb siv.Nyob rau hauv lub xub ntiag ntawm ib tug magnetic teb, magnetic teb tsim cov hlua, qhov ntev ntawm uas muaj feem xyuam rau hom hais thiab lub zog ntawm lub magnetic teb (xws li, qhov sib thooj thiab txav ntawm cov hlau nplaum).Raws li pom nyob rau hauv daim duab 10, cov hlua peb saib yog tsim raws li ib tug neeg particle ua magnetized thiab induces nws lub zos magnetic teb.Cov chaw sib cais no ua rau lwm cov khoom zoo sib xws los sib sau thiab txuas nrog pab pawg cov hlua vim yog lub zog hauv zos los ntawm lub zog hauv zos ntawm kev nyiam thiab kev tawm tsam ntawm lwm cov khoom.
Daim duab qhia (a, b) chains of particles forming in fluid-filled capillaries and (c, d) air-filled trachea.Nco ntsoov tias capillaries thiab trachea tsis tau kos rau qhov ntsuas.Vaj Huam Sib Luag (a) kuj muaj cov lus piav qhia ntawm MF uas muaj Fe3O4 hais nyob rau hauv chains.
Thaum cov hlau nplaum txav hla lub capillary, lub kaum sab xis ntawm txoj hlua particle mus txog qhov tseem ceeb ntawm MP3-5 uas muaj Fe3O4, tom qab ntawd cov hlua particle tsis nyob hauv nws txoj haujlwm qub, tab sis tsiv mus rau qhov chaw tshiab.hlau nplaum.Cov nyhuv no yuav tshwm sim vim qhov saum npoo ntawm iav capillary yog du txaus kom tso cai rau qhov kev txav no tshwm sim.Interestingly, MP6 (CombiMag) tsis coj li no, tej zaum vim hais tias cov khoom me me, muaj cov txheej txheem sib txawv los yog tus nqi ntawm cov khoom, los yog cov khoom muaj peev xwm ua rau lawv muaj peev xwm txav mus los.Qhov sib piv hauv CombiMag particle duab kuj tsis muaj zog, qhia tias cov kua thiab cov khoom yuav muaj tib qhov ntom ntom thiab yog li tsis tuaj yeem txav mus rau ib leeg.Cov khoom tseem tuaj yeem daig yog tias cov hlau nplaum txav nrawm dhau, qhia tias lub zog hlau nplaum tsis tuaj yeem kov yeej kev sib txhuam ntawm cov khoom hauv cov kua dej, qhia tias qhov sib nqus lub zog thiab qhov kev ncua deb ntawm cov hlau nplaum thiab lub hom phiaj yuav tsum tsis txhob tuaj. xav tsis thoob.tseem ceeb.Cov txiaj ntsig no tseem qhia tau tias txawm tias cov hlau nplaum tuaj yeem ntes ntau cov microparticles ntws los ntawm lub hom phiaj, nws tsis zoo li cov hlau nplaum tuaj yeem tso siab rau kev txav CombiMag hais raws li qhov chaw ntawm lub trachea.Yog li, peb tau txiav txim siab tias hauv vivo LV MF cov kev tshawb fawb yuav tsum siv cov hlau nplaum zoo li qub rau lub cev lub cev rau cov chaw tshwj xeeb ntawm cov ntoo hauv cov hlab cua.
Thaum cov khoom xa mus rau hauv lub cev, lawv tsis yooj yim los txheeb xyuas cov ntsiab lus ntawm cov ntaub so ntswg ntawm lub cev, tab sis lawv lub peev xwm tshawb pom tau raug txhim kho los ntawm kev txav cov hlau nplaum horizontally hla lub trachea rau "wiggle" MP cov hlua.Thaum lub sij hawm kev yees duab ua tau, nws yooj yim dua rau kev pom cov khoom txav tom qab tus tsiaj raug tua tib neeg.MP concentrations feem ntau yog siab tshaj ntawm qhov chaw no thaum cov hlau nplaum tau muab tso rau hauv qhov chaw pom, txawm hais tias qee qhov feem ntau pom nyob rau hauv lub trachea.Tsis zoo li cov kev tshawb fawb hauv vitro, cov khoom tsis tuaj yeem raug rub los ntawm lub trachea los ntawm kev txav ntawm cov hlau nplaum.Qhov kev tshawb pom no zoo ib yam li cov hnoos qeev uas npog qhov chaw ntawm lub trachea feem ntau ua cov khoom nqus tau pa, ntxiab rau hauv cov hnoos qeev thiab tom qab tshem tawm los ntawm muco-ciliary clearance mechanism.
Peb xav tias kev siv cov hlau nplaum saum toj thiab hauv qab lub trachea rau kev nyiam (Daim duab 3b) tuaj yeem ua rau muaj qhov sib nqus sib nqus ntau dua, tsis yog cov hlau nplaum sib nqus uas muaj zog heev ntawm ib qho, uas ua rau muaj kev faib tawm ntau dua ntawm cov khoom..Txawm li cas los xij, peb qhov kev tshawb fawb ua ntej tsis pom cov pov thawj tseeb los txhawb qhov kev xav no.Ib yam li ntawd, teeb tsa ib khub hlau nplaum rau repulse (Daim duab 3c) tsis ua rau muaj ntau qhov chaw nyob hauv daim duab.Ob qhov kev tshawb pom no qhia tau hais tias kev teeb tsa dual-magnet tsis txhim kho kev tswj hwm hauv zos ntawm MP taw qhia, thiab qhov ua rau muaj zog sib nqus sib nqus yog qhov nyuaj rau kho, ua rau txoj hauv kev no tsis tshua muaj txiaj ntsig.Ib yam li ntawd, kev taw qhia cov hlau nplaum saum toj no thiab thoob plaws hauv lub trachea (Daim duab 3d) kuj tsis tau nce tus lej ntawm cov khoom seem hauv thaj chaw duab.Qee qhov kev teeb tsa lwm txoj hauv kev no yuav tsis ua tiav vim lawv ua rau txo qis hauv qhov sib nqus lub zog hauv thaj chaw deposition.Yog li, kev teeb tsa ib qho hlau nplaum ntawm 30 degrees (Daim duab 3a) yog suav tias yog qhov yooj yim tshaj plaws thiab ua tau zoo tshaj plaws hauv vivo xeem txoj kev.
Txoj kev tshawb fawb LV-MP tau pom tias thaum LV vectors tau koom ua ke nrog CombiMag thiab xa tom qab raug cuam tshuam rau lub cev thaum muaj cov hlau nplaum, cov qib hloov pauv tau nce ntau hauv cov hlab ntsha piv rau cov tswj.Raws li kev tshawb fawb synchrotron duab thiab LacZ cov txiaj ntsig, qhov chaw sib nqus tau tshwm sim tuaj yeem khaws LV hauv lub ntsws thiab txo cov naj npawb ntawm vectors uas tam sim ntawd nkag mus tob rau hauv lub ntsws.Xws li kev txhim kho lub hom phiaj tuaj yeem ua rau muaj kev ua tau zoo dua thaum txo cov khoom xa tuaj, tsis yog lub hom phiaj kev hloov pauv, inflammatory thiab tiv thaiv kab mob, thiab cov nqi hloov pauv noob.Qhov tseem ceeb, raws li cov chaw tsim khoom, CombiMag tuaj yeem siv ua ke nrog lwm txoj hauv kev hloov cov noob, suav nrog lwm cov kab mob kis (xws li AAV) thiab nucleic acids.